Control Linie
Immunisierenden eine host tier mit die antikörper (s) von einem verschiedene arten können erzeugen sekundäre antikörpern. Für beispiel, injektion maus antikörpern in ein tier andere als eine maus erhöhen anti-maus sekundäre antikörpern. Ziege, esel, und kaninchen sind die am häufigsten verwendet host arten für herstellung von sekundäre antikörpern.
Die häufigsten arten von sekundäre antikörpern sind diejenigen erzeugt gegen eine pooled bevölkerung von immunglobuline von einem ziel arten.
Für beispiel, immunisierenden eine ziege mit gereinigtes maus IgG wird erzeugen ziege anti-maus IgG antikörper, dass wird zu binden alle klassen, schwere und licht ketten (H L) und fragmente von maus IgG sowie jede andere moleküle sharing die streng konserviert domains (e.g., igM teilen die gleiche kappa licht ketten als IgG).
In kontrast, immunisierenden eine ziege mit nur maus IgG1 antikörpern werden erzeugen antikörper maus IgG1 antikörpern und moleküle sharing die streng konserviert domains.
Wegen der hohen grad der erhaltung in die struktur von viele immunglobulin domänen, klasse-spezifische sekundäre antikörpern muss affinität gereinigtes und kreuz-adsorbiert zu erreichen minimale kreuz-reaktion mit andere immunglobuline.
Immobilisierter maus IgG1 antikörpern können zu reinigen, alle ziege antikörpern, dass zu binden maus IgG1 mit die obigen beispiel. Passage durch eine chromatographie spalte (s), die maus IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, etc., würde weitere verfeinern diese anti-maus IgG1 antikörpern zu entfernen sie alle kreuz-reagieren antikörpern mit non-IgG1 isotypes.
Zusätzlich, passage durch spalten enthält immobilisierter serum proteinen aus arten andere als die verwendet zu immunize die host können weitere reinigen sekundäre antikörpern. Diese methode von kreuz-adsorption (oft als "Hoch Kreuz-Adsorbiert") ist eine zusätzliche reinigung schritt empfohlen für anwendungen, wenn mit primäre antikörpern aus mehrere arten und wenn immunglobuline oder andere serum proteine kann vorhanden sein in die proben probed.
Control Linie Produkte
| Antikörper | Anwendung |
| Kaninchen IgG | Für immunodiagnostic: ELISA, SUPER-METALL-DRUCKGUSS-MODELL LFA, CLIA |
| Maus IgG | |
| Maus IgM | |
| Huhn IgY | |
| Ziege Anti Maus IgG | |
| Ziege Anti Kaninchen IgG | |
| Ziege Anti Huhn IgY | |
| Maus Anti Human IgG |
Isotyp Control
Die primäre zweck der isotyp control ist zu bestimmen, dass die bindung der primäre antikörper ist spezifische, eher als nicht-spezifische Fc rezeptoren oder interaktionen mit anderen proteinen. Es können auch binden antikörper wettbewerbsfähigen und führen die gleiche funktion wie funktion-blocking antikörpern.
Die isotyp control sollte ganz im einklang mit der quelle der primäre antikörper, Ig eingabe, und kennzeichnung.
EINE normale serum kann verwendet werden als negative control in immunofluorescence kennzeichnung wenn die primäre antikörper ist polyklonalen. Aufgrund der verschiedenen quellen von fluorescently beschriftet mAbs, unbeschrifteten mAbs aus der gleichen quelle sollte verwendet werden als isotyp kontrollen einstellen hintergrund färbung. Für beispiel: Für beispiel, wenn die primäre antikörper ist maus anti-ratte CD11b und klon OX-42 gereinigtes IgG, seine isotyp ist maus IgG2a, so gereinigtes maus IgG2a kann verwendet werden als die isotyp control oder OX-42.
Isotyp control: bezieht sich auf die gleiche immunglobulin subclass als Moab in unimmunized mäuse, faktoren wie handy autofluorescence, FC rezeptor-vermittelt antikörper bindung, und nicht-spezifische antikörper bindung wurden vor allem als. Wenn direkt immunofluorescence färbung ist verwendet, die isotyp control sollte auch beschriftet mit fluoreszierende pigmente, wie IgG1 FITC, IgG2a, PE, etc. zusätzlich, die isotyp control und Moab-beschriftet fluorochrome konzentration und F:P verhältnis (das verhältnis von beschriftet fluorochrome zu immunglobulin moleküle) sollte die gleiche wie die beste, Die ist vital für genaue einstellung von negativen und positiven zelle wahrzeichen Bedeutung. Verwenden sie nicht eine isotyp steuerung, die nicht spiel MoAb, vorzugsweise ein produkt vorbereitet durch die gleiche labor und mit der gleichen prozess oder methode (wie die gleiche marke).
Isotyp Control Fluss Cytometry
Die Fab fragment der antikörper kann binden an die zelle oberfläche mit niedrigen affinität und nicht-spezifität, vor allem wenn das ist tot oder die zellmembran ist beschädigt; diese nicht-spezifische bindung wird mehr obvious. Daher, isotyp steuert sind oft verwendet in experimente zu bestimmen hintergrund fluoreszenz ebenen.
Die isotyp steuerung verwendet werden, um eine klassische negative referenz in fluss cytometry. Zu erreichen die gleiche kreuz-reaktivität zwischen die isotyp control und die antikörper, die isotyp, arten, fluorescein, fluorescein, protein verhältnis, konzentration, und andere indikatoren muss konsistent.
Vorsichtsmaßnahmen:
1. wenn die antigen ausdruck ist eine bimodale verteilung, und die negative und positive peaks sind getrennt, die experimentellen ergebnisse verstehen können durch die bimodale verteilung.
2. wenn die kultivierten zellen werden müssen erkannt, dann einstellung die isotyp kontrolle auf diese zeit kann nur erhalten einige informationen reflektieren die zelle haftung fähigkeit, und es ist schwierig zu erhalten informationen was seine nicht-spezifische fluoreszenz. Daher, einstellung up eine isotyp control zu erkennen kultivierten zellen ist nicht ideal.
3. wenn eine vielzahl von fluorescein ist verwendet in die experiment zur gleichen zeit, während der analyse, es ist gefunden, dass die fluoreszenz leckage hat einen erheblichen einfluss auf die ergebnisse, und die hintergrund fluoreszenz ist nicht ersichtlich, es ist nicht geeignet, um die isotyp kontrolle auf diese zeit. Gute wahl. (FMO steuert sind zellen von der gleichen art, gefärbt mit alle andere fluoresceins mit einem fluorescein entfernt, so dass die leckage der verschiedenen fluoresceins zu die unbeschrifteten kanal kann manifestiert und die tor platziert werden können in ort, so, ist eine notwendige control für gating. Und die FMO control ist nur wichtig, wenn es ist ätherisches zu unterscheiden zwischen positive und negative genau. FMO control ist jetzt allgemein verwendet in multicolor experimente und ist notwendig für multicolor experimente.)
4. bei verwendung der isotyp control, es ist gefunden, dass die nicht-spezifische bindung niveau ist sehr hoch, die kann durch, um die bindung der nicht-spezifische Fc ende an die zelle, was zu einer nicht-spezifische signal, so zahlen aufmerksamkeit zu Fc blockieren.
5. es ist notwendig zu verstehen, dass die isotyp control ist nur eine referenz zu helfen uns filter heraus einige faktoren, dass einfluss auf die experiment, aber wir können nicht bestimmen die positive und negative cutoff punkte oder set eine tor basierend auf diese. Wir müssen wissen, dass die isotyp control können nur spiegeln die hintergrund fluoreszenz von nicht-spezifische bindung, und die hintergrund fluoreszenz ist auch verursacht durch andere faktoren, wie autofluorescence, hohe entschädigung, antikörper, kennzeichnung methoden, instrumente, andere reagenzien oder daten analyse, und andere faktoren beeinflussen die hintergrund fluoreszenz.
6. es ist notwendig, titrate die ziel antikörper zu reduzieren die hintergrund fluoreszenz von nicht-spezifische bindung, und es ist nicht geeignet, um set eine isotyp control. Aufgrund der übermäßigen menge von antikörpern, negative spitzen shift und basis 3d-klangfeld verbreiterung wird auftreten.
7. wenn zellsignalisierung und zytokine sind erkannt in die experiment, die FMO control und die negative biologische kontrolle sollte eingestellt werden, besondere aufmerksamkeit zu unstimulated zellen oder zellen behandelt mit phosphorylierung inhibitoren.
8. lebensfähigkeit der zellen farbstoff ist hinzugefügt, um die multicolor schema zu entfernen abgestorbene zellen. Weil die nicht-spezifische färbung von zellen getötet ist extreme, wenn nicht entfernt, es führen wird, um höher nicht-spezifische bindung und einfluss auf die experiment.
9. es verfügbar ist, um anderen gesetzt steuert neben die isotyp control in verschiedenen situationen. Für beispiel, für ungefärbt zellen, bestimmen negative steuert für hintergrund und autofluorescence, set die PMT spannung;
Für voll stained zellen, bestimmen einige off-achse veranstaltungen, set die PMT spannung; für einzel-befleckt zellen/vakuum-mikrokügelchen, einstellen entschädigung; unstimulated Oder unbehandelte proben, experimentelle negative kontrolle; positive zellen (stimuliert oder behandelt mit bestimmten drogen), positive praktische control.
